Résumé
Cette vidéo explique le protocole de mini-préparation plasmidique bactérienne, une technique courante en biologie moléculaire pour extraire l'ADN plasmidique des cultures bactériennes. La vidéo couvre la culture d'E. coli, les étapes de lyse, de neutralisation et de lavage pour isoler l'ADN plasmidique, et enfin, l'élution et la quantification de l'ADN purifié.
- Culture d'E. coli dans un bouillon LB avec un antibiotique sélectif.
- Lyse des cellules bactériennes pour libérer l'ADN plasmidique.
- Neutralisation et centrifugation pour séparer l'ADN plasmidique des débris cellulaires.
- Utilisation d'une colonne de silice pour purifier l'ADN plasmidique.
- Elution de l'ADN plasmidique purifié et mesure de sa concentration.
Introduction à la préparation de plasmides bactériens [0:11]
La vidéo commence par une introduction à la préparation de plasmides bactériens, un protocole courant en biologie moléculaire pour extraire l'ADN plasmidique des cultures bactériennes. Les bactéries sont décrites comme de petites usines à ADN, où les plasmides (fragments circulaires d'ADN) sont insérés et répliqués en grandes quantités pour des applications telles que le séquençage ou le clonage. La vidéo souligne la nécessité d'extraire d'abord le plasmide des cellules bactériennes avant de pouvoir effectuer ces expériences. E. coli est la bactérie la plus couramment utilisée à cette fin. Les préparations existent en différentes tailles (mini, midi, maxi, méga, giga), mais la chimie et le principe restent les mêmes. La vidéo précise que plus la culture de départ est importante, plus la quantité d'ADN plasmidique obtenue à la fin de la préparation est importante. La taille la plus courante en laboratoire est la mini-préparation, qui commence avec seulement 1 à 5 ml de culture bactérienne, et c'est celle qui sera démontrée dans la vidéo.
Culture d'E. coli [1:23]
La première étape consiste à cultiver E. coli. Pour cela, il faut du LB (bouillon de Luria-Bertani), un milieu de culture nutritif pour E. coli, auquel on ajoute un antibiotique sélectif. Dans ce cas, E. coli contient un plasmide qui confère une résistance à la kanamycine, donc la kanamycine est ajoutée au LB. Cela garantit que seules les bactéries E. coli contenant le plasmide se développeront, tandis que toute bactérie aléatoire sera tuée par l'antibiotique. Des tubes de culture stériles sont également nécessaires pour éviter toute contamination. Trois ml de LB sont ajoutés aux tubes de culture à l'aide d'une pipette stérile, en veillant à refermer rapidement les tubes pour éviter toute contamination. Ensuite, la culture est inoculée avec E. coli, prélevée soit d'un stock congelé de glycérol, soit d'une colonie sur une boîte de Pétri. Enfin, les cultures inoculées sont placées dans un incubateur à 37 degrés Celsius et agitées à 200 rpm pendant 12 à 16 heures pour permettre aux bactéries de se répliquer. Après cette période, la culture devient trouble, signe que E. coli s'est reproduit et a produit de grandes quantités d'ADN plasmidique.
Mini-préparation : Préparation et Centrifugation [3:12]
Pour la mini-préparation, on peut utiliser un kit commercial ou préparer ses propres réactifs en laboratoire. Les étapes et la chimie générale sont similaires, mais il est important de lire attentivement le protocole car il peut y avoir de légères différences dans les volumes et les temps d'incubation. De nombreux tubes à essai sont nécessaires pour cette mini-préparation. Chaque échantillon nécessite trois tubes : un tube de 1,5 ml pour les premières étapes, un tube avec un insert de colonne pour les étapes intermédiaires et un autre tube de 1,5 ml pour la collecte finale du plasmide. Pour se débarrasser du LB, un ml de la culture est pipeté dans le premier tube de 1 ml et centrifugé pendant une minute à 13 000 rpm. La centrifugation sépare les composants de la culture par densité, les E. coli denses formant un culot au fond du tube. Le LB est ensuite éliminé dans un conteneur de déchets biologiques dangereux.
Lyse, Neutralisation et Centrifugation [5:30]
Pour resuspendre les bactéries, 200 microlitres de tampon de resuspension sont ajoutés et vortexés jusqu'à ce que les bactéries soient redistribuées dans le liquide. Ensuite, 200 microlitres de tampon de lyse sont ajoutés, le tube est doucement inversé plusieurs fois pour mélanger et une minuterie est lancée pour une incubation d'une minute. Après une minute, 400 microlitres de tampon de neutralisation sont ajoutés à chaque échantillon, en inversant doucement le tube immédiatement après l'ajout du tampon. Un précipité épais se forme. Après 2 minutes, ces tubes sont centrifugés à 13 000 rpm pendant 5 minutes. Le tampon de lyse contient un détergent qui déchire les membranes cellulaires lipidiques d'E. coli, libérant ainsi toutes les protéines et le matériel génétique. Le tampon de lyse contient également de l'hydroxyde de sodium, qui dénature les deux types d'ADN bactérien en perturbant les liaisons hydrogène entre les paires de bases. Lors de l'ajout du tampon de neutralisation acide, les molécules d'ADN peuvent se refermer. Les plasmides le font facilement car ils sont relativement petits, mais le génome d'E. coli est trop long et s'emmêle avec tous les débris cellulaires. Le tampon de neutralisation contient également du potassium, qui force les protéines à sortir de la solution, entraînant avec elles l'ADN génomique. Le tampon de neutralisation contient également du RNSA, une enzyme qui dégrade l'ARN.
Purification de l'ADN plasmidique [9:42]
Après la centrifugation, tous les solides, y compris l'ADN génomique, se trouvent dans le culot au fond du tube, et la solution liquide contenant l'ADN plasmidique se trouve au-dessus. Pour purifier davantage l'ADN plasmidique, une colonne de silice est utilisée. La solution est retirée du tube de 1,5 ml, en veillant à ne pas perturber le culot de débris, et pipetée dans la colonne. La colonne et le tube de collecte sont ensuite centrifugés ensemble pendant une minute. Le liquide passe à travers la colonne de silice, et ce faisant, l'ADN adhère à la silice et tout le reste passe à travers. La solution est ensuite éliminée. Deux tampons différents sont utilisés pour laver la colonne. Le premier tampon de lavage élimine toutes les protéines, l'ARN et les composants de la membrane cellulaire restants. 200 microlitres sont ajoutés à la colonne et centrifugés pendant une minute, puis le tampon est éliminé. Le deuxième tampon de lavage élimine tous les sels restants. 400 microlitres de tampon de lavage deux sont ajoutés, centrifugés et la solution est éliminée.
Elution et Quantification de l'ADN plasmidique [12:32]
Pour collecter l'ADN plasmidique, la colonne est transférée dans le tube de collecte final. 30 microlitres de tampon d'élution sont ajoutés à la colonne et laissés reposer pendant une minute. Le tampon d'élution est basique, ce qui déprotonise la silice dans la colonne et la charge négativement. L'ADN étant également chargé négativement, les charges similaires se repoussent, ce qui permet à l'ADN de se détacher de la colonne et de s'écouler dans le tube avec un tampon lors de la centrifugation pendant une minute. L'ADN plasmidique purifié se trouve maintenant dans le tube. La concentration de chaque échantillon de plasmide est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre. Les valeurs 260/230 et 260/280 sont des mesures de qualité et doivent être d'environ 2 et 1,8 respectivement. Les concentrations sont enregistrées dans le cahier de laboratoire et les échantillons de plasmides sont stockés au congélateur à -20 degrés Celsius.
